Editorial Board

심근세포의 수축력 측정을 위한 4-캔틸레버 어레이는 Fig. 2. (a) 와 같이 polymer part 와 glass part 로 구성된다. Polymer part는 금속 스트레인 센서와 상부 표면에 imprinting된 groove가 있다. 배양된 심근세포의 수축력에 따라서 소자의 기계적 변형이 전기적 저항 변화로 발생한다. Glass part는 신호 측정을 위한 전극패드 와 2개의 고정 저항이 형성되었으며, plasma bonding을 통하여 polymer part 와 전기적으로 연결되어 하프-브릿지 회로가 구성된다. 이를 통하여 Fig. 2. (b) 와 같이 세포의 수축, 이완에 따른 캔틸레버의 스트레인 변화를 출력 전압으로 측정 가능하다. 또한 세포의 정렬 및 심근세포 골격을 조직화할 수 있도록 imprinting 된 groove 가 형성되어 수축력 및 성숙도의 증가가 가능하다. Fig. 2 (c)는 캔틸레버 자유단에 하중이 인가되었을 때 발생하는 변위와 스트레인 분포의 유한요소해석 결과를 보여준다. 해석 결과를 바탕으로 금속 스트레인 센서는 캔틸레버의 고정단에서 3 mm 앞부분에 형성되었다.

Fig. 2. 
Design of functional well-plate. (a) Schematic of a 4-cantilever array, (b) Sketch of the device principle, (c) FEM simulation results of polymer cantilever according to contraction force and strain distribution of cardiomyocytes

Micromachining process를 이용하여 제작되는 4-캔틸레버 어레이의 공정 과정을 Fig. 3에 나타내었다. 본 연구에서 사용된 폴리머 캔틸레버는 Si rubber를 사용하였으며, 기존의 PDMS 와 비교하여 상대적으로 높은 Young’s modulus 와 낮은 열 팽창 계수로 인하여 금속이 안정적으로 증착 되고 층간 박리 현상이 발생하지 않는다. Si rubber film 에 nano/micro groove 패턴을 위하여 groove mold 상부에 Si rubber (KEG-2000-80A / B, Shin-Etus) 복합체를 2 g 올려 놓는다. 다음으로는 Si rubber의 두께 조절을 위하여 가장자리에 120 μm 두께의 feeler gauge (NIKO, Feeler 0.12)을 위치시키고, PI(Polyimide) film을 덮고 열-압착기를 사용하여 30 분 동안 130^oC에서 4 MPa의 압력을 가하여 경화하였다 (Fig. 3 (a-1)). 다음으로 groove 가 패턴된 Si rubber 필름의 하부에 shadow mask 를 올려 놓고 E-beam evaporator를 이용하여 Ti/Au (5 nm / 100 nm) 을 증착 하였다(Fig. 3 (a-2)). 배양액 환경에서 장시간 사용될 센서의 안정성 향상을 위하여 PDMS encapsulation layer (~ 10 μm)를 산소 기반의 대기압 플라즈마 처리(CUTE-1MPR, Femto Science Inc.) 후에 화학적으로 접합하였다 (Fig. 3 (a-3)). Roll to plate 장비 (TSUKATANI, BFX) 와 pinnacle를 사용하여 4-캔틸레버 어레이의 형상을 정의하였다 (Fig. 3 (a-4)).

Fig. 3. 
Process flow for the fabrication of the proposed 4-cantilever array integrated with a half bridge sensor

다음은 신호 측정을 위한 전극패드 및 고정 저항이 형성된 glass part의 제작 공정이다. Glass part는 폴리머 캔틸레버의 기판으로 사용되며, 폴리머 캔틸레버 몸체에 형성된 전극에 외력이 인가되는 것을 방지한다. 다음은 glass body의 상세한 제작 공정이다. Glass 기판에 micro well 구성을 위하여 금속 masking layer (Cr/Au)를 패터닝한다 (Fig. 3 (b-1)). 유리 식각을 위하여 HF(Hydrogen fluoride) 사용하여 10 mm (etching rate: 5 mm/min) 깊이로 유리를 식각하였다(Fig. 3 (b-2)). 전극패드 와 고정 저항을 형성하기 위하여 패터닝 후 금속을 식각 하였다(Fig. 3 (b-3)). 캔틸레버의 자중에 의한 처짐을 방지하고 안정적인 세포 배양을 위하여 micro well 영역에 SU-8을 이용한 supporter 구조체를 패터닝 후 dicing saw (AM Technology, NDS200)를 사용하여 19.72 mm × 12.20 mm 크기로 dicing 하였다(Fig. 3 (b-4)). 마지막으로 polymer part와 glass part를 산소 기반의 대기압 플라즈마 처리 (CUTE-1MPR, Femto Science Inc.) 하여 화학적으로 접착하였다(Fig. 3 (c)).

모든 동물 실험은 전남대학교 동물윤리위원회로부터 승인 후 진행되었다. NRVM(Neonatal Rat Ventricular Myocytes) isolation은 생후 3일 이내의 Sprague-Dawley Rat에서 적출된 심장을 심방과 심실로 분리하였다. 다음으로 ADS buffer solution (NaCl 120 mM, HEPES 20 mM, NaH2PO4 8 mM, D-glucose 6 mM, KCl 5 mM, MgSO4 0.8 mM, DI water 1L, pH 7.35)을 이용하여 분리된 심실을 washing 한 후 Enzyme Solution (Collagenase 0.5 mg/ml, Pancreatin 0.6 mg/ml, ADS buffer solution 50 ml) 및 preplating을 통해 단일 cardiomyocytes를 획득하였다. 제작된 폴리머 캔틸레버 표면에 fibronectin (Corning)을 효과적으로 코팅하기 위하여 산소 기반의 대기압 플라즈마 처리 (CUTE-1MPR, Femto Science Inc., 80 W, 30 sec)를 통하여 표면 개질 후 fibronectin을 dip-coating 하였다. 획득한 심근세포는 1,000 cell/mm² 밀도로 폴리머 캔틸레버 전면에 분주하였으며, 변위 측정은 배양 후 10일 동안 진행하였다. 또한 심근세포의 배양기간 동안 세포 배양액은 72시간 간격으로 교체하였다.

Fig 4 (a, b)는 제작된 4-캔틸레버 어레이와 기능성 multi well-plate의 광학 이미지를 나타낸다. 캔틸레버 상부 표면에는 imprinting된 nano/micro groove 가 위치하고, 고정단에는 금속 스트레인 센서가 집적화 되었다. 인가된 변위에 대한 스트레인 센서의 특성 평가를 위하여 Lab-VIEW 기반 데이터 수집 시스템 (PXI-4071, National Instruments Inc., Austin, TX, USA)을 사용하여 인가된 변위에 대한 스트레인 센서의 저항 변화를 실시간으로 측정하였다. 5 1/2 디지트로 2 선 저항을 측정 값의 표준 편차는 0.01 Ω 이다[9].

Fig. 4. 
Optical image of (a) Fabricated 4-cantilever array, (b) Functional multi well-plate combined with 4-cantilever array, (c) Resistance change as a function of cantilever displacement

제작된 폴리머 캔틸레버 어레이에 심근세포의 수축/이완과 유사한 거동을 재현하기 위하여 motorized stage를 사용하였다. Stage 상부에 고정된 홀더를 이용하여 캔틸레버 자유단에 집중 하중을 인가하여 캔틸레버에 굽힘을 발생시키고 집적화된 스트레인 센서에 저항 변화를 일으켰다. Ti/Au 스트레인 센서에 총 100 μm의 변위 (strain range: 0 ~ 2.89 × 10^-4)를 인가한 후 발생한 저항 변화는 300 mΩ 이다. Fig. 4 (c)는 초기상태에서 100 μm까지 5 μm 간격으로 일정하게 변위를 인가하였을 때 저항 변화를 나타낸다. 제작된 폴리머 캔틸레버는 인가된 변위에 따라서 선형적인 저항 변화량(R² > 0.99)을 나타낸다.

Drug toxicity screening platform의 특성 평가를 위하여 테스트 모듈과 측정 시스템을 구성하였다(Fig. 5 (a)). 테스트 모듈은 캔틸레버를 압전 구동기 위에 올려놓고 외부 하우징을 통하여 고정한 다음 함수 발생기와 piezo-amp를 이용하여 0 ~ 40 V까지 증폭하여 구동하였다. 측정된 1차 공진 주파수는 1.558 kHz 로 선형적으로 증가된 구동 전압에서 집적화된 하프-브릿지 회로의 출력 전압과 캔틸레버 자유단의 변위는 선형적(R² > 0.99)으로 증가 하였다(Fig. 5 (b)). Motorized stage를 사용하여 구성된 미소 변위 발생기는 외부에서 일정한 힘으로 캔틸레버에 힘을 인가할 수 있으며, 인가되는 힘의 크기 변화에 따라 비례하여 발생하는 저항 변화는 휘스톤 브릿지 회로를 통하여 drug toxicity screening platform에 내장된 noise filter와 Op-Amp를 이용하여 증폭된 전압의 변화로 나타난다. 인가된 힘은 최대 약 760 nN 으로 244 mV 출력값을 얻을 수 있으며, 출력 전압 변화는 3 mV/mm 이다 (Fig. 5(c, d)).

Fig. 5. 
(a) Schematic of the measurement system (b) Resonance amplitude is linearly proportional to the actuation drive voltage (R² > 0.99), (c, d) Resistance change with an input of various pulsed force to cantilever

심근세포는 배양 기질의 형태학적 변화에 의하여 이방성의 특징을 보인다. 심근 세포의 높은 구조적 발달을 위하여 imprinting된 groove는 1.5 μm, 3 μm, 5 μm, 7 μm의 line and space를 갖는다. 패턴된 기질에서 심근세포의 이방성 특징을 확인할 수 있으며, groove 크기에 따라 서로 다른 수축력을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 배양 기질의 형태학적 변화가 세포 골격의 조직화 및 성숙도 뿐만 아니라 부착율을 향상 시켰다는 사실을 증명한다. 또한 향상된 세포 골격과 정렬된 심근세포에 의한 수축력의 집중은 캔틸레버 변위를 약 5배 증가하는 결과를 나타내었다(Fig. 6 (f)). 이와 같은 결과는 배양 기질의 형태학적 변화를 통한 세포 골격의 조직화 및 성숙도 향상이라는 생물학적 의미와 폴리머 캔틸레버의 변위 향상을 통한 추가적인 감도 증가를 기대할 수 있다.

Fig. 6. 
Adhesion rate of cardiomyocytes cultured on various substrates (a) flat, (b) 1.5 mm groove, (c) 3 mm groove, (d) 5 mm groove, (e) 7 mm groove, (f) Changes in contractility according to the culture period of cardiomyocytes cultured on various substrates

위의 결과를 바탕으로 In vitro 환경에서 수축력과 심박수에 영향을 주는 약물에 대한 용량-반응성 연구를 수행하였다. Ca²⁺ 채널 억제제인 Verapamil 처리에 따른 심근세포의 수축력 감소 반응과 500 nM의 농도에서 EC₅₀을 확인하였다(Fig 7). 기능성 well-plate의 스크리닝 능력은 기존의 광학 시스템이 갖는 복잡성을 해결하고 간단한 측정 방식을 통하여 정확한 데이터 수집 능력을 확인하였다.

Fig. 7. 
Drug dose-response studies of cardiomyocytes cultured on various substrates.